Sekwencjonowanie DNA – technika odczytywania sekwencji, czyli kolejności par nukleotydowych w cząsteczce DNA.

Sekwencjonowanie dokonuje się obecnie głównie za pomocą zautomatyzowanych sekwenatorów. Manualne sekwencjonowanie stosuje się przy opracowywaniu nowatorskich metod, w niektórych laboratoriach dla krótkich fragmentów lub podczas ćwiczeń[potrzebny przypis]. 

GACACCATCGAATGGCGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAAGAGAGTCAATTCAGGG
gdzie: A – deoksyadenozyna; C – deoksycytydyna; G – deoksyguanozyna; T – tymidyna

Metody historyczne

Sekwencjonowania DNA metodą Sangera z użyciem znakowanych dideoksynukleotydów
A – przykładowa sekwencja DNA
B – przyłączenie startowego oligonukleotydu do nici matrycowej i kierunek syntezy DNA
C – produkty syntezy DNA, zakończone fluorescencyjnie znakowanymi dideoksynukleotydami (kolorowe litery)
D – elektroforegram rozdziału otrzymanej mieszaniny fragmentów w elektroforezie kapilarnej wraz z zidentyfikowaną sekwencją (powyżej)
Przykładowy pirogram uzyskany z pirosekwencjonowania

Historyczną już i wypieraną metodą jest opracowana w 1977 r. metoda Sangera, oparta o syntezę DNA przez polimerazę DNA in vitro[1]. Do reakcji dodaje się niewielką ilość trifosforanów dideoksynukleotydów (ddNTP), które są wbudowywane w DNA, ale ich dołączenie uniemożliwia dalsze wydłużanie nici. W ten sposób otrzymuje się fragmenty DNA o różnej długości zakończone specyficznym nukleotydem. Produkty reakcji rozdziela się elektroforetycznie, co powoduje ich segregację pod względem wielkości.

Autorem alternatywnej metody sekwencjonowania DNA, z wykorzystaniem specyficznej, chemicznej degradacji DNA, byli Walter Gilbert i Allan Maxam (metoda Maxama-Gilberta)[2]. Gilbert wraz z Frederickiem Sangerem otrzymali za to osiągnięcie nagrodę Nobla w dziedzinie chemii. Metoda Maxama-Gilberta obecnie jest rzadko stosowana[3].

Metody współczesne

Obecnie odczyt sekwencji w metodzie Sangera został zautomatyzowany dzięki wykorzystaniu znakowanych fluorescencyjnie trifosforanów dideoksynukleotydów i pozwala na odczyt 300–1000 par zasad z jednej kapilary lub linii na żelu[potrzebny przypis].

Nowoczesne (2013) aparaty do sekwencjonowania DNA są w stanie pracować z szybkością rzędu milionów par zasad dziennie[4]. Tranzystory polowe DNA umożliwiają użycie natywnego DNA w hybrydyzacji do mikromacierzy i odczyt w czasie rzeczywistym.

Nagroda Archon Genomics X PRIZE w wysokości 10 mln dolarów czeka na ośrodek, który będzie w stanie zsekwencjonować 100 genomów ludzkich w ciągu 10 dni[5]. Pierwsze sekwencjonowanie genomu człowieka zajęło wiele lat (zob. Projekt poznania ludzkiego genomu).

Nowoczesne metody sekwencjonowania DNA są na tyle tanie, iż setki tysięcy osób zapłaciły za zbadanie swojego DNA i wzięły udział w Projekcie Genograficznym. Ta względna taniość umożliwiła również rozwój m.in. genetyki genealogicznej oraz wielu rodzajów badań testujących obecność mutacji.

Metody rozwojowe

  • pirosekwencjonowanie; jego wersja "sekwencjonowanie 454" pozwala odczytać 300 MBp na dzień w jednej maszynie. Metoda ta jest szczególnie przydatna do sekwencjonowania aDNA.
  • bezpośredniego odczytu[potrzebny przypis]:
    • nanosekwencjonowanie. Przesuwająca się cząsteczka DNA poprzez centrum aktywne modyfikowanych polimeraz jest odczytywana bezpośrednio. W roku 2006 szybkość takiego odczytu wynosiła 1 MBp/s dla pojedynczego nanometrowego czujnika[6].
    • mikroskopowe

Historia rozwoju metod sekwencjonowania DNA

  • 1953 – opracowanie modelu podwójnej helisy DNA przez Jamesa Watsona i Francisa Cricka
  • 1972 – opracowanie sposobów izolacji materiału do dalszych badań. Rozwój technologii rekombinacji umożliwiający izolację dowolnych fragmentów DNA i ich replikację.
  • 1977 – Allan Maxam i Walter Gilbert ogłaszają publikację pt. Sekwencjonowanie DNA przez chemiczną degradację. W tym samym czasie Sanger opublikował też metodę sekwencjonowania DNA przez syntezę katalizowaną enzymatycznie.
  • 1980 – Fred Sanger i Walter Gilbert otrzymali nagrodę Nobla
  • 1982 – utworzono Genbank – publicznie dostępną bazę danych sekwencji DNA
    • Andre Marion i Samuel Eletr utworzyli firmę Applied Biosystems, która w tym okresie zdominowała automatyczne sekwencjonowanie DNA
  • 1982 – Akiyoshi Wada zbudował roboty sekwencyjne dla firmy Hitachi.
  • 1984 – badacze z MRC odczytali kompletną sekwencję wirusa Epstein-Barr, 170 kb.
  • 1997 – zsekwencjonowano 5Mb genom bakterii Escherichia coli.
  • 2001, 15 lutego – Konsorcjum HUGO opublikowało sekwencję genomu ludzkiego w Nature.
  • 2001, 16 lutego – firma Celera Genomics opublikowała sekwencję genomu ludzkiego w Science.

Zobacz też

Przypisy

  1. ↑ F. Sanger, S. Nicklen, A.R. Coulson, DNA sequencing with chain-terminating inhibitors, „Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America”, 74 (12), 1977, s. 5463–5467, PMID: 271968, PMCID: PMC431765.
  2. ↑ A.M. Maxam, W. Gilbert, A new method for sequencing DNA, „Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America”, 74 (2), 1977, s. 560–564, PMID: 265521, PMCID: PMC392330.
  3. ↑ The Nobel Prize in Chemistry 1958. nobelprize.org. [dostęp 2013-11-20]. (ang.).
  4. ↑ J. Soh, P. Gordon, C. Sensen: Genome Annotation. Chapman & Hall/CRC, 2013, s. 1. ISBN 978-1-4398-41174.
  5. ↑ X PRIZE Foundation Announces Largest Medical Prize in History. $10 Million Archon X PRIZE for Genomics Challenges Private Companies to Map 100 Human Genomes in 10 Days [online], genomics.xprize.org, 4 października 2006 [zarchiwizowane z adresu 2007-09-08] (ang.).
  6. ↑ Technology Overview [online], visigenbio.com [zarchiwizowane z adresu 2006-07-12] (ang.).

Witaj

Uczę się języka hebrajskiego. Tutaj go sobie utrwalam.

Źródło

Zawartość tej strony pochodzi stąd.

Odsyłacze

Generator Margonem

Podziel się